人腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒說明書（二） 
上海原鑫生物科技從事科研試劑的優(yōu)質(zhì)企業(yè)。該文章詳細(xì)的介紹了人腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒的樣本收集及儲存、試劑準(zhǔn)備、檢測步驟、結(jié)果判斷、參數(shù)表征和常見問題及解決方法這六個方面。本文僅供于科研研究，不得用于臨床試驗(yàn)！
一、樣本收集及儲存
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清： 將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下1000 ×g 離心10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并 于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。 2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復(fù)凍融。 3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混 合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。 注意事項(xiàng)：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高 于標(biāo)準(zhǔn)品的最高值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。
二、試劑準(zhǔn)備
1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下復(fù)溫。 2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用超純水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋 成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。 3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：在標(biāo)準(zhǔn)品中加入1ml標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至完全溶解，按照濃度為2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156.25pg/ml、78.13pg/ml、39.06pg/ml進(jìn)行等比稀釋，具體操作如下圖所示。
三、檢測步驟
1. 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計，在標(biāo)準(zhǔn)品與樣本孔中加樣100ul，空白對照不加 2. 25℃避光孵育2h 3. 棄去液體，用洗滌液清洗4次，每次每孔至少加洗滌液300ul，洗完后吸水紙上拍干 4. 加入酶標(biāo)抗體溶液100ul，空白對照不加，25℃避光孵育1h 5. 同步驟3 6. 每孔加入底物A、B各50ul，25℃避光孵育20min，顯色淺可適當(dāng)延長孵育時間 7. 加入終止液50ul，10min內(nèi)在450nm波長處測OD值
四、結(jié)果判斷
1. 用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。 2. 計算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值 3. 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中TNFA含量可通過對應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。 若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)
五、參數(shù)表征
1.數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線
2. 準(zhǔn)確度：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R>0.95 3. 檢測范圍：39.06-2500pg/ml(如超出檢測范圍，需將樣本稀釋后檢測) 4. 靈敏度：≤39.06pg/ml 4 特異性：不與其他可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng) 5 重復(fù)性：變異系數(shù)≤15% 6 儲存條件：2-8℃冷藏 7 有效期：6個月
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